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sds-page法鉴定鸡肉蛋白热变性的研究-dyy-6c型电泳仪,dycz-24dn型电泳槽

[导读] 利用水溶性蛋白的热变性质,应用水溶性蛋白质热变性原理结合企业的实际加工条件建立了sdspage方法,测定熟制禽肉蛋白变性程度。结果显示鸡肉肌肉组织经不同温度处理,所得电泳图谱具有显著差异,反映蛋白质变性与温度存在的密切相关性。

材料与仪器:tris碱、sds、甘氨酸、10%sds、甘油、二硫苏糖醇(dtt)、溴酚蓝、2-巯基乙醇、高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒。蛋白质为marker bm524,life science products&services。开封后溶于200μl的色谱纯水中,分装于20个小管内(每管10μl),于沸水中加热5 min后,保存于-20℃。使用前于室温融化,加dtt至100 mmol·l-1,于沸水中加热5 min后上样。5×样品缓冲液10 ml:1m的tris-hcl(ph6.8)吸取0.6 ml,50%的甘油吸取5 ml,10%sds准备2 ml,2-巯基乙醇准备0.5 ml,1%溴酚蓝准备1 ml,以及0.9 ml的去离子水。电泳缓冲液:称取tris碱6 g、甘氨酸28.8 g、sds 1 g,加去离子水定容至1 l,调节ph为8.3。凝胶板(规格:8.6 cm×6.8 cm×0.1 cm)[生工生物工程(上海)股份有限公司],dyy-6c型电泳仪,dycz-24dn型电泳槽(北京市六一仪器厂);恒温水浴锅。蛋白质的提取:称取20 g样品,加入20 m l超纯水,在10 000 r·min-1条件下均质5 min,均质后在4 300 r·min-1条件下离心20 min,上清液过0.45μm滤膜,取1 600μl分成两份,每份800μl。其中一份室温放置,命名样品c(control);另一份置于8个pcr玻璃管中,每管100μl,在水浴锅中按温度要求加热1 min,合并8个pcr玻璃管中的提取液于1个1.5 ml离心管中,命名为h(heat)。两份样品在8 000 r·min-1离心5 min,得上清液。各取20μl上清液,分别加入60μl水稀释,然后加入20μl的5×样品缓冲液,混匀,100℃加热5 min,即为供试样品。sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳:用微量注射器吸取样品20μl加入样品孔底部,并随着染料水平的升高而升高注射器针头,避免混入气泡,加样完成后进行电泳,采用恒压模式,电压为200 v,蓝色条带接近于分离胶底部时(约30 min),停止电泳。将凝胶板放入盛有100 ml蒸馏水的培养皿中,在摇床上振荡5 min,重复洗涤3次。在干净的脱色装置中,加入20 ml的2×染色液a,20 ml蒸馏水,2.4 ml染色液b,充分混合,将胶放入,置于摇床上,振荡染色30 min。然后将凝胶板放入另一个干净的器皿中用超纯水冲洗胶,在加入20 ml的2×脱色液和20 ml超纯水,置于摇床上,振荡清洗30 min,重复3次,取出凝胶板,并照相。

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